G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素 說明書

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基本信息

產品簡介

        G418 Sulfate（G418硫酸鹽），也稱作Geneticin（遺傳霉素），是一種結構類似于慶大霉素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素，通過影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來干擾蛋白合成，對原核和真核等細胞都有毒性，包括細菌、酵母、高等植物和哺乳動物細胞，也包括原生動物和蠕蟲。其抗性基因（主要為neo基因）位于轉座子Tn601（903）或Tn5（來源于細菌），但是可以在真核細胞中表達。通過基因重組技術將這些抗性基因導入細胞，使其獲得對G418的耐藥性，從而用來篩選和維持培養(yǎng)攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。 哺乳動物細胞中，當抗性基因neo被整合進真核細胞基因組后，使其編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3')II）。此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產生抗性。穩(wěn)轉細胞株篩選實驗，需要建立殺滅曲線（劑量反應曲線）確定殺死無抗性細胞的zui低有效濃度。 植物細胞中，通過轉染攜帶nptII基因的抗性質粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶，這個酶使得多種抗生素喪失活性，包括G418，卡那霉素和巴龍霉素。

使用說明

1. G418儲存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）

    （1）活力單位的換算

根據(jù)此公式進行換算：（1000/A₀）×A₁=A₂，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應的質檢報告，或者瓶子上的標簽。A₁是想配制的活性G418濃度。A₂是實際稱重的粉末與體積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為：750 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配制10 mL的G418儲存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取663.3 mg粉末。

（2）除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內使其wan全溶解。

先用5 mL無菌去離子水預濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。

 【注】

      ①不要對混濁的溶液進行過濾，因為混濁的溶液意味著未wan全溶解，過濾過程中會造成藥物損失，降低終液的活性。

      ②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液。

 2. 常用篩選濃度

 一般來說，剛開始篩選轉化子需要高濃度的G418，并用一個較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長條件，細胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確定最佳篩選濃度。

 通常情況，哺乳動物細胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細胞：10-100 μg/mL；酵母細胞：500-1000 μg/mL。

 以下是一些細胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

3. 殺滅曲線的建立

      【注意事項】為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素zui低濃度，可通過建立殺滅曲線來實現(xiàn)，至少選擇6個濃度。處理分裂期的細胞時G418的活性zui強，因此在添加G418之前需要讓細胞培養(yǎng)一段時間。

（1）第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO₂培養(yǎng)過夜。

     【注】對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量。

（2）根據(jù)細胞類型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

（3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。

（4）接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

（5）按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數(shù)來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數(shù)細胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉染細胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉染細胞的篩選

      （1）轉染48 h后，用含有適當濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

    【注】細胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷成效更優(yōu)。當細胞過于稠密，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果，細胞稀釋至豐度不超過25%。

（2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

（3）篩選7天后觀察并評估細胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細胞類型，轉染以及篩選效果。

（4）挑取并轉移5-10個抗性克隆于35 mm細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

（5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

運輸與保存方法

常溫運輸。-20℃避光保存，有效期3年。避免受潮，否則會降低抗生素活力。

注意事項

（1）本品不可高壓滅菌；

（2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會產生交叉活性。

（3）配制G418溶液時，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液及工作液。

（4）G418加入培養(yǎng)體系中未轉染的細胞有可能不會被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細胞密度過高。另外，快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞（未轉染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉染細胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

（5）即使加入殺死劑量的G418，細胞可能會繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

（6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。